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 　　1.概述

　　在延時實驗期間確保活細胞成像裝置的機械穩定性非常重要。電動載物臺的位置恢復中的振動效應或容差會導致圖像序列的（輕微）偏移。每個外部運動都可以覆蓋觀察到的細胞運動。當使用更高的放大倍數或處理緩慢遷移的細胞時，這一點尤為重要，因為每個細胞所覆蓋的距離相對較小。本應用說明將介紹一種計算外部引起的像素偏移的方法，然后將其從細胞軌跡坐標中減去。所得數據總結了實際的細胞遷移參數。

　　2.應用實例

圖 1. 在實驗過程中，stage top incubator位移產生了約90像素的永久像素偏移

　　圖1顯示了對圖像序列中像素偏移進行校正的需要。在進行實驗時，stage top incubator的位移產生了約90像素的永久像素偏移。繪制細胞軌跡（圖2）和分析遷移參數（表1）給出了定向細胞遷移的錯誤印象。然而，將像素偏移納入數據分析表明，明顯存在的定向細胞遷移僅由像素偏移產生。

　　所給出的方法不僅適用于補償一個大的像素偏移，而且也可以用于整個測量過程中可能發生的小偏移。

圖2. 0到24小時內40個細胞的軌跡圖。左圖顯示未校正數據，右圖顯示校正數據

　　表1. 未校正數據與校正數據偏移參數對比,獲得的未校正軌跡值表明定向細胞遷移，即使這僅歸因于現有的像素偏移。

　　3.原理

　　在圖像序列中，校正像素偏移需要幾個工作步驟：

　　1. 跟蹤每次時間間隔測量的30到40個細胞。例如，我們建議使用ImageJ插件手動跟蹤。該插件能夠量化對象在時間堆棧的幀之間的移動。

　　2. 每個趨化室都需要一個參考軌道。必須在整個圖像序列進行跟蹤剛性點，例如通道邊界的定義位置。當使用膠原纖維作為剛性點時，請確保不會因細胞運動產生的張力而發生纖維運動。參考軌跡的第一幅圖像用作比較值（Xref,1 和 Yref1）。必須計算所有后續圖像（Xshift,i 和Yshift,i）和比較值之間的像素偏移（Xref,i 和 Yref,i）。

　　3. 更正你的細胞軌跡。獲得的每幅圖像的軌跡坐標（Xi和Yi）必須通過計算出的像素位移進行校正。這是通過從原始數據細胞軌跡坐標中減去像素位移來執行的。因此，需要復制細胞格軌跡數據并將參考軌跡數據粘貼到同一個Excel文件中（圖3）。

　　4. 將校正后的值復制到新的Excel文件中。此文件應另存為excel（.xls 或 .xlsx）和文本文檔 (.txt)。exel文件允許進行后續更改，而文本文件可以導入趨化和遷移工具（ibidi提供的免費軟件），用于繪制數據和分析趨化效應。

圖3. 圖像序列中小像素偏移校正的示例計算。計算每個參考圖片的像素偏移并從原始數據中減去以獲得校正后的軌跡坐標

　　5. 檢查獲得的值正確性。使用趨化和遷移工具打開原始以及更正后的跟蹤文件，以檢查您是否僅更正了數據，而沒有錯誤地創建人工細胞運動（圖4）。圖4中顯示的人工細胞運動歸因于跟蹤細胞時對像素偏移的延遲反應。與參考軌跡相比，這種延遲反應無法通過這種方法進行補償。

圖4 . 測試數據更正很重要。左圖顯示未經校正的原始數據，中間圖顯示像素位移校正數據，右圖顯示人工創建的細胞運動。