date:2019-03-02 13:55:07
細(xì)胞遷移發(fā)生在很多重要的生理過程中。比如，胚胎發(fā)育，組織損傷和傷口愈合的過程中細(xì)胞的遷移就是受到調(diào)控的。相反，細(xì)胞遷移在許多病理情況比如癌癥轉(zhuǎn)移和炎癥下是失調(diào)的。不足為奇，許多細(xì)胞遷移的原理已經(jīng)在很多情況下研究過了。
1. 傷口愈合和遷移實(shí)驗(yàn)的應(yīng)用
傷口愈合和遷移實(shí)驗(yàn)是廣泛用于不同條件下分析細(xì)胞遷移的方法。
他們有助于理解下面相關(guān)的科學(xué)問題。
1 不同條件下遷移和傷口愈合研究：
細(xì)胞如何在不同條件下遷移（比如，被特定的化合物/增強(qiáng)劑/抑制劑處理后，SiRNA或者CRISPR/Cas9基因沉默后，底物硬度改變后，或者基質(zhì)組成改變后）
2 高通量藥物篩選：
哪一種藥物可以改變特定細(xì)胞的遷移速率（比如，癌細(xì)胞）
3 細(xì)胞相互作用研究：
細(xì)胞是保持相互接觸，還是異常遷移。遷移過程中細(xì)胞是如何相互作用的。 細(xì)胞自主性的遷移能力如何？
4 2D侵襲實(shí)驗(yàn)：
兩種不同類型細(xì)胞如何相互作用（比如腫瘤細(xì)胞和成纖維細(xì)胞）
和一般的傷口愈合和遷移不同，定向遷移實(shí)驗(yàn)，比如細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)，測(cè)定在2D或者3D環(huán)境下濃度梯度依賴的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。
2D侵襲實(shí)驗(yàn)中兩種不同類型的細(xì)胞 抑制劑或增強(qiáng)劑對(duì)傷口愈合影響的示例
2. 如何做一個(gè)傷口愈合和遷移實(shí)驗(yàn)
典型的傷口愈合和遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果就是隨著時(shí)間的變化細(xì)胞覆蓋面積（傷口閉合）的變化。
進(jìn)行傷口愈合和遷移實(shí)驗(yàn)是一個(gè)非常簡(jiǎn)單的操作。
1 在細(xì)胞單層間制造出一個(gè)物理傷口。
2 在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行拍照，或者進(jìn)行實(shí)時(shí)成像觀察細(xì)胞遷移到傷口的過程。
3 采用手動(dòng)或者自動(dòng)化軟件分析傷口閉合的速率，這就是典型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
盡管傷口愈合實(shí)驗(yàn)很簡(jiǎn)單，但是許多因素會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此要控制好這些因素。
下面我們討論一下傷口愈合的實(shí)驗(yàn)設(shè)置和原理。此外，我們還要討論一些需要標(biāo)準(zhǔn)化的參數(shù)，從而獲得可重復(fù)，穩(wěn)定的結(jié)果。
MCF7細(xì)胞傷口形成后傷口閉合的活細(xì)胞成像圖
傷口愈合實(shí)驗(yàn)流程圖
開始實(shí)驗(yàn)之前需要回答以下問題：
1 能否重復(fù)細(xì)胞培養(yǎng)條件？
由于許多外部因子可能影響到傷口愈合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，這就需要事先開發(fā)出一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)。
整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中的步驟需要保持一致。如果可以，每一次實(shí)驗(yàn)所用到的設(shè)備，細(xì)胞代數(shù)，培養(yǎng)液替換次數(shù)，試劑和耗材都應(yīng)當(dāng)一樣。
2 應(yīng)該用哪一種細(xì)胞培養(yǎng)器皿？
細(xì)胞培養(yǎng)器皿需要有一個(gè)薄底（-170μm），這樣對(duì)于高分辨率活細(xì)胞成像和倒置顯微鏡是出色的。（比如，ibidi多聚物玻片）培養(yǎng)器皿的大小需要便于傷口的形成。根據(jù)樣本數(shù)量，ibidi有μ培養(yǎng)皿（35mm高壁）的培養(yǎng)插件或者μ-24孔培養(yǎng)板可以選擇使用。如果不需要高分辨率熒光顯微鏡成像，培養(yǎng)插件也可以自己插入到各種規(guī)格的培養(yǎng)器皿里，比如培養(yǎng)皿，細(xì)胞培養(yǎng)小室，多孔板。
3 應(yīng)該使用哪種基底？
哪種基底取決于細(xì)胞類型和實(shí)驗(yàn)條件。組織處理的基底可以給細(xì)胞提供足夠的吸附。
就像ibidi多聚物玻片，適用于大多數(shù)細(xì)胞類型。然而有些細(xì)胞類型需要一些特殊的包被。
關(guān)于詳細(xì)的如何自己包被μ玻片和μ培養(yǎng)皿可以查看ibidi細(xì)胞包被的應(yīng)用指南。
4 需不需要抑制細(xì)胞增殖？
在傷口愈合實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞不僅僅會(huì)遷移到傷口處，而且也會(huì)增殖。在形成傷口前，可以使用增殖抑制劑比如mitomycin 或者 actinomycin C處理細(xì)胞來抑制增殖。但是需要事先確定好劑量和相應(yīng)的對(duì)照，這樣細(xì)胞不會(huì)因?yàn)樯L(zhǎng)抑制的藥物而造成細(xì)胞凋亡或者改變了遷移能力。
5 理想的細(xì)胞密度是多少？
理想狀態(tài)下，傷口愈合實(shí)驗(yàn)應(yīng)該是在顯微鏡下觀察到細(xì)胞單層長(zhǎng)滿后立即進(jìn)行。細(xì)胞接種密度需要根據(jù)不同細(xì)胞類型來分別確定。出色的狀態(tài)就是細(xì)胞在接種24小時(shí)形成單細(xì)胞層。
6 如何形成傷口？
生成的傷口的一致性對(duì)于傷口愈合實(shí)驗(yàn)是其重要。目前有幾種在單層細(xì)胞形成傷口的方法：用針或者槍頭劃，放入一個(gè)插件或者膜具，化學(xué)表面處理，或者用電處理等，不同方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。
7 傷口閉合如何監(jiān)測(cè)？
在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行拍照觀察傷口閉合是可以的。但是對(duì)于絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來講，活細(xì)胞成像是精確，也是很方便地監(jiān)測(cè)傷口閉合的。
3. 傷口愈合實(shí)驗(yàn)流程：
1樣本制備
步驟：使用Ibidi培養(yǎng)插件形成的傷口，由于無細(xì)胞傷口的大小固定，這就確保了高度可重復(fù)性。
在合適的培養(yǎng)器皿里面選擇恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)插件。接種培養(yǎng)細(xì)胞到顯微鏡下長(zhǎng)滿，形成單層。讓細(xì)胞生長(zhǎng)大約24小時(shí)，如果有必要，可以用增殖抑制劑處理細(xì)胞，然后移除培養(yǎng)插件形成傷口。
Ibidi的解決方法：
Ibidi培養(yǎng)插件2孔，3孔，四孔是特定大小細(xì)胞傷口的硅膠插件，用于傷口愈合，遷移，2D侵襲實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞共培養(yǎng)。
他們有預(yù)裝在μ35mm培養(yǎng)皿中的獨(dú)立插件，也有25個(gè)整體放在運(yùn)輸培養(yǎng)皿中自己手動(dòng)插入的。
它提供了一種快捷便利的實(shí)驗(yàn)方法。
培養(yǎng)插件兩孔24是預(yù)裝在24孔板里面的，是非常劃算的，可以直接用于高通量實(shí)驗(yàn)。
Ibidiμ兩孔載玻片的兩個(gè)孔的大小剛好可以插入培養(yǎng)插件。
2 活細(xì)胞成像
步驟：絕大多數(shù)情況下，傷口形成后立即使用相差顯微鏡監(jiān)測(cè)細(xì)胞的狀況。既可以在不同時(shí)間點(diǎn)（比如6和12小時(shí)后）拍攝傷口照片，也可以進(jìn)行活細(xì)胞成像。通常監(jiān)測(cè)細(xì)胞24小時(shí)左右就足夠了。想要精確地分析，那么整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中就需要觀察傷口的同一個(gè)位置。
Ibidi的解決方法：
Ibidi加熱和氣體孵育系統(tǒng)在顯微鏡下提供了一個(gè)生理環(huán)境。使得在傷口愈合和遷移實(shí)驗(yàn)過程中可以進(jìn)行活細(xì)胞成像。
3 數(shù)據(jù)分析
步驟：一個(gè)典型的傷口愈合或者遷移實(shí)驗(yàn)生成GB數(shù)量的圖像數(shù)據(jù)，需要通過手動(dòng)圖像分或者自動(dòng)化軟件析進(jìn)一步處理。眾多的實(shí)驗(yàn)方法中，主要的結(jié)果就是傷口閉合的速度。其他結(jié)果可能包括無細(xì)胞區(qū)域和細(xì)胞覆蓋區(qū)域的測(cè)定。
Ibidi的解決方法：
使用傷口愈合ACAS圖像分析軟件，ibidi提供了一種省時(shí)全自動(dòng)化定量分析傷口愈合和遷移實(shí)驗(yàn)的方法。
它包括分析無細(xì)胞區(qū)域，細(xì)胞覆蓋區(qū)域以及傷口閉合速度。
4. 使用不同方法在細(xì)胞單層制造傷口：
1 插入：接種細(xì)胞前，在培養(yǎng)表面置入插件/模塊來物理性排除細(xì)胞。
2 劃痕：在表面劃痕（劃痕實(shí)驗(yàn)）機(jī)械去除細(xì)胞。
3 阻抗：在特定區(qū)域內(nèi)用電壓去除細(xì)胞。
Ibidi提供了三種不同的培養(yǎng)插件用于形成傷口：ibidi培養(yǎng)插件2孔，3孔以及4孔。
由于特殊設(shè)計(jì)的底部，培養(yǎng)插件黏附在表面，阻礙了壁下任何細(xì)胞的生長(zhǎng)。移除培養(yǎng)插件后，新形成的無細(xì)胞傷口處沒有任何殘留。這種方法可以重復(fù)地形成高度一致的沒有任何細(xì)胞的傷口
當(dāng)放置在平整，干凈的表面，培養(yǎng)插件2孔給培養(yǎng)的細(xì)胞提供了兩個(gè)儲(chǔ)液池，中間被500μm厚度的壁給分隔開。細(xì)胞接種在儲(chǔ)液池中培養(yǎng)，一直到他們貼壁，形成單細(xì)胞層。移除表面的硅膠插件后會(huì)形成兩個(gè)精確大小的細(xì)胞斑塊，由一個(gè)大小和分割壁一樣寬度的區(qū)域所分開。接著就可以通過活細(xì)胞成像或者在不同時(shí)間點(diǎn)拍照來監(jiān)測(cè)細(xì)胞遷移。
培養(yǎng)插件3孔提供了三個(gè)細(xì)胞儲(chǔ)液池。它可以形成兩個(gè)無細(xì)胞傷口，每個(gè)500μm. 因而適用于分析兩個(gè)技術(shù)重復(fù)樣本或者不同細(xì)胞類型的遷移。
培養(yǎng)插件4孔提供四個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)儲(chǔ)液池。除了四個(gè)500μm的無細(xì)胞區(qū)域外，還包括一個(gè)1mm的中間傷口區(qū)域。培養(yǎng)插件4孔可以觀察四個(gè)技術(shù)重復(fù)樣本或者不同細(xì)胞類型的遷移。
培養(yǎng)插件3孔/4孔都可以在藥物處理或者基因沉默/過表達(dá)（比如通過CRISPR/Cas9, SiRNA, mRNA）
后進(jìn)行細(xì)胞遷的分析。重要的是，未處理的對(duì)照組可以在同一個(gè)培養(yǎng)器皿里面接種，分析，共享同樣的培養(yǎng)液。
和其他傷口形成技術(shù)不同，ibidi的培養(yǎng)插件適合2D侵襲實(shí)驗(yàn)和共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)可以實(shí)驗(yàn)
兩種，三種甚至四種細(xì)胞類型或者處理方式。
5. ibidi培養(yǎng)插件部分客戶發(fā)表文章：
Inhibition of Tunneling Nanotube (TNT) Formation and Human T-cell Leukemia Virus Type 1 (HTLV-1) Transmission by Cytarabine.
Scientific Reports, 2018, 10.1038/s41598-018-29391-w
Stapled peptide inhibitors of RAB25 target context-specific phenotypes in cancer.
Nature Communications, 2017, 10.1038/s41467-017-00888-8
Endothelial Notch signalling limits angiogenesis via control of artery formation.
Nature Cell Biology, 2017, 10.1038/ncb3574
EphA2 Drives the Segregation of Ras-Transformed Epithelial Cells from Normal Neighbors.
Current Biology, 2016, http://dx.doi.org/10.1016/j.cub.2016.09.037
A molecular mechanotransduction pathway regulates collective migration of epithelial cells.
Nat Cell Biol, 2015, 10.1038/ncb3115
Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog
Nature, 2012, 10.1038/nature10807
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